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    Western Blot选错内参文章被编辑社拒收了?WTF!?




    实验室有人做缺氧时用了GAPDH做内参,结果编辑社以此为理由给拒了,理由很简单,GAPDH是三梭酸循环途径中的一个酶,缺氧状态可能会改变其表达。在细胞进行诱导实验处于应激、缺氧、糖代谢紊乱时最好不要选择GAPDH为内参。Western Blot即免疫印迹试验,可以利用Western Blot来比较在不同条件下,不同细胞组织中目的蛋白表达量的差异,属于定性,半定量试验,参照物必不可少。有了参照物才能准确地比较目的蛋白表达量的差异。它们在各个组织细胞中表达相对恒定,不会因为外部条件变化而引起表达量的变化。而且内参可以监测整个试验体系是否正常,比如蛋白提取过程,转膜,显色等。下面就介绍下选择内参应遵循的原则:

    样本种属来源:

    首先考虑样本来源于何种物种。

    1)如果是哺乳动物的组织或细胞,主要有beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na(+)/K(+) ATPase等;

    2)植物来源样本,可以选择plant actin、Rubisco等;

    3)其他来源样本,可参照文献选择相关内参抗体;

    目的蛋白表达部位:

    就一般蛋白检测来说beta Actin、beta Tubulin、GAPDH等就可以了,样本蛋白是特殊结构如核蛋白,胞膜蛋白时,就体现了选择正确内参的价值。

    1)常用核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3、PCNA等。

    2)胞膜蛋白内参抗体:Na(+)/K(+) ATPase等。

    3)线粒体蛋白内参抗体:VDAC1、COX Ⅳ等。

    目的蛋白分子量:

    beta Actin、beta Tubulin、GAPDH的分子量分别是42kd,50kd,37kd,目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差5kd以上,才能分开目的蛋白和内参;

    三种常用内参特点:

    beta Actin,肌动蛋白,细胞骨架蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。beta Actin作为内参是得到公认的,针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞质内,表达量非常丰富。但是在一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内,beta Actin的表达量就很少。

    GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,该酶是糖酵解反应中的一个酶,几乎在所有组织细胞中都高水平表达,在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的,且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下,会增加GAPDH在特定细胞和组织中的表达。

    beta Tubulin微管蛋白,细胞骨架蛋白。作为内参抗体,beta Tubulin表达通常不会发生改变,因此被广泛用于Western Blot内参,也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

    不同实验处理时如何选择内参:

    1)不同的内参在选择上也要根据具体的样本情况选择,没有一种内参能适用所有的组织和细胞样本。比如,血红细胞(因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性)样本就不适合以上3种常用内参。如果使用会导致结果很差或者没有结果。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

    2)在做多组织多细胞样本对比表达量时,最好选用GAPDH作为内参,因为GAPDH是代谢类蛋白,在活组织中表达比较恒定。而beta Actin和beta Tubulin是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性,如脑组织的tubulin的表达会高一些(因为神经细胞的轴突和树突都由tubulin维持结构),而actin的表达量可能会低一些。再比如,骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了tubulin的表达改变和特化。心肌的beta Actin的表达量可能变少,而alpha Actin表达量高。因为这些组织的差异,现在慢慢采用总Actin和总tubulin作为内参,可以尽量减少一些组织表达量差异。

    3)做各种分泌液样本的时候,如血浆,乳汁,组织液等,以上的3种内参也不是很合适。由于没有完整的细胞结构,所以只能选择一些分泌蛋白作为内参,或者采用其他方式作为内参。

    4)做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,选择结构蛋白作为内参,如beta Actin和beta Tubulin。因为GAPDH是代谢类蛋白,表达量有可能会受到诱导处理的影响。同时,做修饰性抗体的Western Blot实验,最好也带上同抗原的总抗作为阳性对照。


    5)做Western Blot实验时,内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况,尤其是用X胶片曝光的。如果内参条带过度曝光,条带会显得很宽,妨碍对条带正确强度的判读,进而影响对其他实验结果的判断。最好的内参结果是: 窄窄的,黑色实心条带。


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    图:HONBIOTECH内参抗体验证。

     

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